Ricerca RNA SARS CoV-2

Rilevazione del gene N specifico per il virus SARS CoV-2

Il sistema On-Site Real Time PCR Rapid Shineway è in grado di individuare la presenza dell’RNA specifico per il gene N specifico del virus SARS CoV-2 in pool di 6, 12 e 18 tamponi oro-rinofaringei  congiuntamente all’amplificazione di un controllo interno. La possibilità di analizzare tamponi in pool  riduce notevolmente i tempi di lavorazione del laboratorio permettendo in due amplificazioni la  valutazione di fino a 54 tamponi oro-rinofaringei. (Laboratorio COVID ASL-VT – Rete CORONet Lazio)

La simitecno  distribuisce sistemi di controllo molecolare per il coronavirus.  Non siamo un'ente sanitaria che effettua tamponi e non possiamo dare informazioni su stati di salute e analisi effettuate. 

RT-PCR Real Time Portatile – Test molecolare Covid-19.

Sistema Real Time PCR per analisi di acidi nucleici SWM-02.

Ricerca RNA SARS CoV-2 in pool di tamponi oro-rinofaringei mediante il sistema POCT (Point Of Care Testing) On-Site Real Time PCR Rapid Shineway.

MATERIALI:

Sono stati realizzati e valutati 6 pool di tamponi oro-rinofaringei precedentemente analizzati presso il Laboratorio Covid ASL-VT appartenente alla RETE regione Lazio CORONet. I pool sono stati realizzati miscelando 1 tampone oro-rinofaringeo positivo con tamponi oro-rinofaringei negativi secondo lo schema in Tabella 1 e 2.

POOL 1:6 POOL 1:12 POOL 1:18
TAMPONE POSITIVO
(n.0729003301)
TAMPONI NEGATIVI
TAMPONE POSITIVO
(n.0729003301)
TAMPONI NEGATIVI
TAMPONE POSITIVO
(n.0729003301)
TAMPONI NEGATIVI
50 microL
250 microL
25 microL
275 microL
16,7 microL
283,3 microL
Volume totale 300 microL
Volume totale 300 microL
Volume totale 300 microL

Tabella 1: pool realizzati miscelando il campione positivo n. 0729003301 con 5 (pool 1:6), 11 (pool 1:12) e 17 (pool 1:18) tamponi negativi, per un volume totale di 300 microL.

POOL 1:6 POOL 1:12 POOL 1:18
TAMPONE POSITIVO
(n.0729004201)
TAMPONI NEGATIVI
TAMPONE POSITIVO
(n.0729004201)
TAMPONI NEGATIVI
TAMPONE POSITIVO
(n.0729004201)
TAMPONI NEGATIVI
50 microL
250 microL
25 microL
275 microL
16,7 microL
283,3 microL
Volume totale 300 microL
Volume totale 300 microL
Volume totale 300 microL

Tabella 2: pool realizzati miscelando il campione positivo n. 0729003301 con 5 (pool 1:6), 11 (pool 1:12) e 17 (pool 1:18) tamponi negativi, per un volume totale di 300 microL.

Le caratteristiche dei tamponi oro-rinofaringei utilizzati sono riassunte nella Tabella 3, dove sono riassunti i risultati della ricerca dei geni N, RdRP ed E
realizzata presso il Laboratorio della rete CORONet e la quantificazione assoluta del campione realizzata presso il Laboratorio  della “Divisione tecnologie e metodologie per la salvaguardia della salute” dell’ENEA Casaccia.

TAMPONE N. Copie/microL Gene N (Ct) Gene RdRP (Ct) Gene E (Ct)
0729004201
0,5
39,44
/
/
0729003301
600
24,48
22,75
21,53

Tabella 3: caratteristiche dei tamponi positivi utilizzati per la realizzazione dei pool.

METODI

Ogni pool è stato analizzato in triplicato realizzando l’estrazione dell’RNA virale mediante l’estrattore automatico “GenePure Pro – NPA32” della Bioer Technology ed il kit “MagaBio plus Virus DNA/RNA purification kit II – BSC71S1E ” della Bioer Technology. L’amplificazione Real Time PCR è stata eseguite per mezzo di “On-Site Real Time PCR – SWM-01” della Shineway ed il kit “Detection Kit for Novel Coronavirus (2019-nCoV) RNA (Fluorescent PCR)” della DAAN Gene, in grado di rilevare il gene N specifico per il virus SARS CoV-2 ed un controllo interno (…). Il protocollo di amplificazione impiegato è specificato in Tabella 4.

Step Numero di cicli Temperatura Tempo (s) Misura della fluorescenza
Reverse Cycle
1
50
900
Precycle
1
95
900
Thermal Cycle1
45
94
15
Off
55
45
On

Tabella 4: protocollo di amplificazione in Real Time PCR

RISULTATI

Entrambi i tamponi descritti in Tabella 3 sono stati analizzati in singolo con il sistema POCT (Point Of Care Testing) On-Site Real Time PCR Rapid Shineway, ed hanno dato esito positivo per la ricerca del gene N. (risultati di Cesi…).
Il Tampone n. 0729004201 contiene un  numero di copie (0,5 copie/microL) al limite di rilevazione del Laboratorio della rete CORONet ed è stato rilevato anche dal sistema in valutazione SWM-01.
Tutti i pool realizzati con il Tampone n. 0729004201 hanno dato esito negativo come prevedibile dal momento che la concentrazione nei pool del campione risulta minore del limite di rilevazione del sistema (0,5 copie/microL).
Tutti i pool realizzati con il Tampone n. 0729003301 hanno dato esito positivo nei diversi triplicati come descritto nella Figura 1 e nella Tabella 5.

Figura 1: risultati in Ct dell’amplificazione del gene N mediante il sistema On-Site Real Time PCR Rapid Shineway di tre pool in triplicato.

POOL 1:6 (Ct) POOL 1:12 (Ct) POOL 1:18 (Ct)
1° replicato
24,64
24,82
23,54
2° replicato
26,10
23,72
26,03
3° replicato
27,43
27,27
26,47

Tabella 6: risultati in Ct dell’amplificazione del gene N mediante il sistema On-Site Real Time PCR Rapid Shineway di tre pool in triplicato.

Nella Figura 2 e nella Tabella 7 sono riportati i valori della MEDIA e SD (Standard Deviation) dei Ct per i tre pool calcolati sui triplicati di analisi.

Figura 2: Media e SD risultati in Ct dell’amplificazione del gene N mediante il sistema On-Site Real Time PCR Rapid Shineway dei tre pool, calcolati sui triplicati di analisi.

POOL 1:6 (Ct) POOL 1:12 (Ct) POOL 1:18 (Ct)
MEDIA
24,33
25,28
27,06
S.D.
+/- 0,57
+/- 1,11
+/- 0,42

Tabella 7: Media e SD risultati in Ct dell’amplificazione del gene N mediante il sistema On-Site Real Time PCR Rapid Shineway dei tre pool, calcolati sui triplicati di analisi.

DISCUSSIONE

Il sistema On-Site Real Time PCR Rapid Shineway è in grado di individuare la presenza dell’RNA specifico per il gene N specifico del virus SARS CoV-2 in pool di 6, 12 e 18 tamponi oro-rinofaringei. La possibilità di analizzare tamponi in pool riduce notevolmente i tempi di lavorazione del laboratorio permettendo in una amplificazione la valutazione di 54 tamponi oro-rinofaringei.

SHINEWAY è la PCR piu' utilizzata nei centri Covid di tipo DRIVE-IN del Lazio